加酶標(biāo):于各反應(yīng)孔中,加入新鮮稀釋的酶標(biāo)(經(jīng)滴定后的稀釋度)0.1ml。37℃ 孵育0.5~1小時,洗滌。4. 加底物液顯色:于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液0.1ml,37℃ 10~30分鐘。5. 終止反應(yīng):于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。6. 結(jié)果判定:可于白色背景上,直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深,陽性程度越強(qiáng),陰性反應(yīng)為無色或極淺,依據(jù)所呈顏色的深淺,以“ ”、“-”號表示。也可測OD值:在ELISA檢測儀上,于450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值,若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

使用一次性的吸頭以免交叉污染,吸取終止液和底物A、B液時,避免使用帶金屬部分的加樣器。8. 使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。9. 洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干,不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。10. 底物A應(yīng)揮發(fā),避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感,避免長時間暴露于光下。避免用手接觸,有毒。實(shí)驗完成后應(yīng)立即讀取OD值。11. 加入試劑的順序應(yīng)一致,以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。12. 按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。
哺乳動物細(xì)胞溶質(zhì)中的SOD呈綠色,并且由兩種亞單位構(gòu)成,一種含有銅,另一種含有鋅(Cu/Zn-SOD)。線粒體和細(xì)菌SOD為紅紫色并含有錳(Mn-SOD)。E.coli含有Mn-SOD和Fe-SOD。為了測定SOD的活性,研究人員嘗試了許多間接的或者直接的方法,其中,NBT的間接法為常用,因為它很方便。但是,NBT法有幾個缺點(diǎn),例如生成的染料水溶性差,而且會和氧化酶的還原型發(fā)生反應(yīng)。雖然cytochrome C法也常被用來做SOD檢測,但它和超氧化物反應(yīng)過于劇烈,不能測定低水平的SOD。