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什么是熒光顯微鏡？

熒光顯微鏡也是光學(xué)顯微鏡的一種，主要的區(qū)別是二者的激發(fā)波長(zhǎng)不同。由此決定了熒光顯微鏡與普通光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)和使用方法上的不同。

熒光顯微鏡是熒光細(xì)胞化學(xué)的基本工具。它是由光源、濾板系統(tǒng)和光學(xué)系統(tǒng)等主要部件組成。是利用一定波長(zhǎng)的光激發(fā)標(biāo)本發(fā)射熒光，通過(guò)物鏡和目鏡系統(tǒng)放大以觀察標(biāo)本的熒光圖像。

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熒光顯微鏡的工作原理

光源多采用200W的超高壓燈作光源，它是用石英玻璃制作，中間呈球形，工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高，當(dāng)完全蒸發(fā)時(shí)，可達(dá)50~70個(gè)標(biāo)準(zhǔn)大氣壓力，這一過(guò)程一般約需5~15min。超高壓燈的發(fā)光是電極間放電使分子不斷解離和還原過(guò)程中發(fā)射光量的結(jié)果。它發(fā)射很強(qiáng)的紫外和藍(lán)紫光，足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。

超高壓燈也散發(fā)大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環(huán)境溫度不宜太高。

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熒光顯微鏡——濾色系統(tǒng)

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激發(fā)濾板 根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，可選用以下三類激發(fā)濾板，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光。

紫外光激發(fā)濾板:此濾板可使400nm以下的紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見光通過(guò)。

紫外藍(lán)光激發(fā)濾板:此濾板可使300~450nm范圍內(nèi)的光通過(guò)。常用型號(hào)為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

紫藍(lán)光激發(fā)濾板:它可使350~490nm的光通過(guò)。常用型號(hào)為QB24(BG12)。

大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達(dá)明色素)可用藍(lán)綠濾板(如B-7)激發(fā)。

開始采用金屬膜干涉濾板，由于針對(duì)性強(qiáng)，波長(zhǎng)適當(dāng)，因而激發(fā)效果比較玻璃濾更好。

激發(fā)濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。

熒光顯微鏡的使用方法

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(1)打開燈源，超高壓燈要預(yù)熱15min才能達(dá)到高的亮點(diǎn)。

(2)透射式熒光顯微鏡需在光源與暗視野聚光器之間裝上所要求的激發(fā)濾片，在物鏡的后面裝上相應(yīng)的壓制濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發(fā)濾片、雙色束分離器、壓制濾片的插塊。

(3)用低倍鏡觀察，根據(jù)不同型號(hào)熒光顯微鏡的調(diào)節(jié)裝置，調(diào)整光源中心，使其位于整個(gè)照明光斑的中央。

(4)放置標(biāo)本片，調(diào)焦后即可觀察。使用中應(yīng)注意:未裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷;用油鏡觀察標(biāo)本時(shí)，必須用無(wú)熒光的特殊鏡油;高壓燈關(guān)閉后不能立即重新打開，需待燈完全冷卻后才能再啟動(dòng)，否則會(huì)不穩(wěn)定，影響燈壽命。

(5)觀察。例如:在熒光顯微鏡下用藍(lán)紫光濾光片，觀察到經(jīng)0.01%熒光染料染色的細(xì)胞，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)被激發(fā)產(chǎn)生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。