原位雜交電話「思特進(jìn)」

原位雜交技術(shù)基本原理

原位雜交技術(shù)的基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放6射性或非放6射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測(cè)DNA或RNA互補(bǔ)配對(duì)，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測(cè)手段將待測(cè)核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。

為顯示特定的核酸序列必須具備3個(gè)重要條件：組織、細(xì)胞或染色體的固定、具有能與特定片段互補(bǔ)的核苷酸序列(即探針)、有與探針結(jié)合的標(biāo)記物。

原位雜交組織（或細(xì)胞）化學(xué)技術(shù)簡(jiǎn)稱原位雜交（In situ hybridization, ISH）是應(yīng)用已知堿基順序并帶有標(biāo)記物的核酸探針與組織細(xì)胞內(nèi)待測(cè)的核酸，按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，然后用與標(biāo)記物相應(yīng)的檢測(cè)系統(tǒng)，通過組織化學(xué)或免3疫組織化學(xué)方法在核酸原有位置進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位、定性和定量研究。為分子水平研究細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)及有關(guān)細(xì)胞5因子的調(diào)控提供了有效的工具?？梢暈榻M織化學(xué)與免3疫組織化學(xué)的重大突破。

原位雜交不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保護(hù)組織和細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。

在條件都得到滿足的情況下，雜交的成敗就取決于保溫時(shí)間。時(shí)間短了，雜交反應(yīng)不完成；時(shí)間長(zhǎng)了也無益，會(huì)引起非特異結(jié)合增多。一般雜交反應(yīng)要進(jìn)行20h左右。1966年Britten和Kohne推薦用Cot =值來計(jì)算雜交反應(yīng)時(shí)間。Cot 值實(shí)際上是雜交液中單鏈起始濃度（Co）和 反應(yīng)時(shí)間（t）的乘積。實(shí)驗(yàn)表明Cot =100時(shí)，雜交反應(yīng)基本完成。Cot=0，基本上沒有雜交。例如在液相雜交中未標(biāo)記的DNA 400μg/ml（按單股DNA每微克 紫外吸收值為0.024計(jì)算，總的吸收值為 9.6），如果反應(yīng)時(shí)間為21h，那么對(duì)于未標(biāo)記的DNA來說，Cot =9.6/21 =100.8,，雜交完成了。對(duì)標(biāo)記DN A（濃度為0.1μg/ml）來說Cot值為0.05，這就充分排除了標(biāo)記DNA的自我復(fù)性。Tm值25℃時(shí)雜交zui佳，所以首先要根據(jù)公式（4）計(jì)算雜交體Tm 值。由此式可見，通過調(diào)節(jié)鹽濃度、甲酰胺濃度和雜交溫度來控制所需的嚴(yán)格性。



根據(jù)不同的雜交實(shí)驗(yàn)要求，應(yīng)選擇不同的核酸探針。在大多數(shù)情況下，可以選擇克0隆的DNA或cDNA雙鏈探針。但是在有些情況下，必須選用其它類型的探針如寡核苷酸探針和RNA探針。例如，在檢測(cè)靶序列上的單個(gè)堿基改變時(shí)應(yīng)選用寡核苷酸探針，在檢測(cè)單鏈靶序列時(shí)應(yīng)選用與其互補(bǔ)的DNA單鏈探針（通過克0隆人M13噬菌體DNA獲得）或RNA探針，寡核苷酸探針也可。長(zhǎng)的雙鏈DNA探針特異性較強(qiáng)，適宜檢測(cè)復(fù)雜的靶核苷酸序列和病原體 ，但不適宜于組織原位雜交，因?yàn)樗灰淄高^細(xì)胞膜進(jìn)入胞內(nèi)或核內(nèi)。在這種情況下，寡核苷酸探針和短的PCR標(biāo)記探針（80～150bp）具有較大的優(yōu)越性。