pcr實(shí)驗(yàn)室分子生物學(xué)檢測(cè)「在線咨詢」

ELISA 是一種結(jié)合抗原、抗ti特異性反應(yīng)和酶對(duì)底物高xiao催化作用的高敏感性免yi學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗ti的固相化及抗原或抗ti的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗ti仍保持其免yi學(xué)活性，酶標(biāo)記的抗原或抗ti既保留其免yi學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗ti或抗原)與固相載體表面的抗原或抗ti起反應(yīng)，洗滌使固相載體上形成的抗原抗ti復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)，再加入酶標(biāo)記的抗原或抗ti，通過(guò)反應(yīng)使其結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶含量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。EMSA實(shí)驗(yàn)EMSA:凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)和DNA序列相結(jié)合的技術(shù)，初用于研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用，可用于定性和定量分析。加入酶反應(yīng)的底物，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。

miRNA測(cè)序

microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。microRNA通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)（新發(fā)現(xiàn)miRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)）。miRNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動(dòng)物、植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的miRNA表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。用1ml70%乙醇洗滌沉淀物1次，離心12000rpm，5min。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技術(shù)以及第二代測(cè)序技術(shù)?；诘诙鷾y(cè)序技術(shù)的miRNA測(cè)序，可以一次獲得數(shù)百萬(wàn)條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的miRNA及其表達(dá)差異，為研究miRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。結(jié)束反應(yīng),PCR產(chǎn)物放置于4°C待電泳檢測(cè)或-20°C長(zhǎng)期保存。

二、大腸菌群檢驗(yàn)方法:

由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關(guān)的細(xì)菌，即:需氧及兼性厭氧、在37°C能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無(wú)芽胞。因此大腸菌群的檢測(cè)一般都是按照它的定義進(jìn)行。 目前國(guó)內(nèi)采用的進(jìn)出口食品大腸菌群檢測(cè)方法主要有國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和原國(guó)家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)方法在檢測(cè)程序上略有不同。標(biāo)準(zhǔn)的生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究?jī)?nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、ceRNA網(wǎng)絡(luò)、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可以將這幾種RNA聯(lián)合起來(lái)分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。

(一)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法，即:乳糖發(fā)酵試驗(yàn)、分離培養(yǎng)和證實(shí)試驗(yàn)。乳糖發(fā)酵試驗(yàn):樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36士1C培養(yǎng)48土2h，觀察是否產(chǎn)氣。分離培養(yǎng):將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，36士1°C培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。證實(shí)試驗(yàn):挑取平板上的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。腺病毒包裝原理介紹腺病毒是一種沒(méi)有包膜的直徑為79-90nm的顆粒，由252個(gè)殼粒呈二十面體排列構(gòu)成。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管36士1°C培養(yǎng)24土2h,觀察產(chǎn)氣情況。

報(bào)告:

根據(jù)證實(shí)為大腸陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每100ml ( g)大腸菌群的MPN值。具體操作參見(jiàn)GB4789. 3-94 《中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測(cè)定》

(二)原國(guó)家商檢局制訂的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，等效采用美國(guó)FDA的標(biāo)準(zhǔn)方法，用于對(duì)出口食品中的大腸進(jìn)行檢測(cè)。本方法采用兩步法：推測(cè)試驗(yàn):樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯。36士1C培養(yǎng)48士2h，觀察是否產(chǎn)氣。證實(shí)試驗(yàn):將產(chǎn)氣管培養(yǎng)物接種煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯管中，36士1°C培養(yǎng)48士2h，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽(yáng)性。分子實(shí)驗(yàn)介紹——熒光檢測(cè)細(xì)胞熒光染色是以熒光物質(zhì)標(biāo)記而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)。查MPN表，報(bào)告每ml(g)樣品中大腸菌群的MPN值。具體操作參見(jiàn)SN0169-92《中華人民共和國(guó)進(jìn)出口商品檢驗(yàn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸檢驗(yàn)方法》

EMSA實(shí)驗(yàn)

EMSA:凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)和DNA序列相結(jié)合的技術(shù)，初用于研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用，可用于定性和定量分析。分為2種類型：同位素標(biāo)記探針，非同位素標(biāo)記探針。

通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚bing烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測(cè)RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來(lái)確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。隨后設(shè)計(jì)BSP引物進(jìn)行PCR，在擴(kuò)增過(guò)程中尿嘧定全部轉(zhuǎn)化為胸腺嘧定，zui后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序就可以判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生jia基化，稱為BSP-直接測(cè)序法。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來(lái)確定特異結(jié)合。