浙江細胞實驗-南京英瀚斯生物科技-細胞實驗外包

細胞分化

細胞分化是指同一來源的細胞逐漸產(chǎn)生出形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征各不相同的細胞類群的過程，其結(jié)果是在空間上細胞產(chǎn)生差異，在時間上同一細胞與其從前的狀態(tài)有所不同。細胞分化的本質(zhì)是基因組在時間和空間上的選擇性表達，通過不同基因表達的開啟或關閉，終產(chǎn)生標志性蛋白質(zhì)。細胞誘導是指將一群不同類型或者形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征存在差異的細胞通過生物學、物理學等手段，將之轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂邢嗨?相同形態(tài)結(jié)構(gòu)、功能特征的細胞群體的過程。

 細胞ELISPOT檢測    

     1．培養(yǎng)板的預處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，浙江細胞實驗，棄掉板中的處理液，細胞實驗外包公司，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細胞，用毛細吸管輕輕吹散細胞團后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數(shù)細胞后，用1640液重新懸浮細胞，配成所需濃度；

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，細胞實驗外包，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色的斑點。

大鼠gu髓間充質(zhì)gan細胞的分離

操作方法

(1 )取SD大鼠( 2周齡)，頸椎脫臼法處死后立即用75%乙醇浸泡，細胞實驗外包選哪家，移入超凈工作臺內(nèi)，用大頭針固定大鼠四肢于工作臺面的泡沫板上。

(2)碘酒擦拭四肢，再用酒精棉球擦拭，無菌條件下用滅菌消毒后的鑷子和剪刀分離出大鼠股骨和脛骨，剔除骨頭表面肌肉， PBS溶液沖洗兩遍。

(3 )從中間剪斷股骨和脛骨，用2ml無菌注she器吸取DMEM/F 12溶液沖出gu髓細胞多次，再用針頭吹打，吸管吸入離心管內(nèi)，1000r/min離心5min，棄上清，用PBS重懸細胞。

(4 )緩慢將細胞懸液加入預先裝有5mL淋巴細胞分離液的15mL離心管內(nèi)，保持細胞懸液在淋巴細胞分離液上層，注意不要攪動液面，保持二者分層界面。

(5 ) 2000rpm離心15-25min，離心后溶液分4層，吸取中間骨sui基質(zhì)細胞層(白色渾濁狀)， PBS洗三次。

(6)用含15%胎牛xue清及青鏈mei素的DMEM/F 12以106/mL的細胞濃度接種于25cm2培養(yǎng)瓶中， 置37°C、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

( 7 ) 24小時后棄去培養(yǎng)液(看細胞貼壁情況)，PBS沖洗2-3次去除末貼壁細胞，加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。以后每3d半量換液1次，-般10d細胞生長融合。

(8 )經(jīng)0.25%胰酶消化，1 : 2傳代，其后一般3-5d傳代1次，選取生長良好的第三代細胞進行后續(xù)實驗。

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