流式細(xì)胞消化系統(tǒng)模型「英瀚斯」

細(xì)胞實驗介紹——流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期和凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：

細(xì)胞周期：指細(xì)胞從前一次分裂結(jié)束起到下一次分裂結(jié)束為止的活動過程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期組成。軟瓊脂培養(yǎng)克l隆形成試驗基本步驟:(1)取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0。G0/G1期：有絲分裂發(fā)生，細(xì)胞分裂成兩個細(xì)胞，進(jìn)入下一個細(xì)胞周期，或者進(jìn)入靜止期（G0期），而G0期從DNA含量上無法與G1期區(qū)分，細(xì)胞開始RNA和蛋白質(zhì)的合成，但DNA含量仍保持二倍體。S期：DNA開始合成，細(xì)胞核內(nèi)DNA的含量介于G1期和G2期之間。G2期和M期：當(dāng)DNA成為4倍體時，細(xì)胞進(jìn)入G2期。G2期細(xì)胞繼續(xù)合成RNA及蛋白質(zhì)，直到進(jìn)入M期。

PI法是經(jīng)典的周期檢測方法。3%的上層瓊脂，每孔加1ml上層瓊脂和100ul單細(xì)胞懸液(約1000ell/wel)，混勻，室溫凝固。PI為插入性核酸熒光染料，能選擇性的嵌入核酸DNA和RNA雙鏈螺旋的堿基之間與之結(jié)合，其結(jié)合的量與DNA的含量成正比例關(guān)系，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，就可以得到細(xì)胞周期各個階段的DNA分布狀態(tài)，從而計算出各個期的百分含量。

一般流程：細(xì)胞收集-70%酒精固定過夜-PI染色-流式細(xì)胞儀檢測。

細(xì)胞凋亡：細(xì)胞凋亡的早期就有細(xì)胞膜表面破損發(fā)生。從而使得研發(fā)或生產(chǎn)者不必以雜交瘤細(xì)胞為載體保留該，而可以以堿基序列的形式進(jìn)行保存和傳播交流、鑒定。破損時凋亡細(xì)胞表面的磷脂腺絲氨酸(PS)可以從細(xì)胞內(nèi)膜翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞的外膜。該過程發(fā)生在之前，檢測PS的表達(dá)，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2 依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS有很高的親和性，并且可以與暴露于細(xì)胞外的PS相結(jié)合。利用這一原理，可以將AnnexinV標(biāo)記熒光來識別早期的細(xì)胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)來區(qū)分凋亡和壞死細(xì)胞。PI的膜通透性很差，因而只能標(biāo)記壞死的細(xì)胞。

一般流程：細(xì)胞收集-PI-AnnexinV標(biāo)記-流式細(xì)胞儀檢測。

結(jié)果示例：

                                   圖 A 細(xì)胞周期檢測圖；B 細(xì)胞凋亡檢測圖

自噬流檢測

自噬是調(diào)節(jié)真核細(xì)鵬生長、和能量代謝的重要生物學(xué)機(jī)制。調(diào)亡I期(pro-apoptosisnuclei)的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象(cavitati)的空泡結(jié)構(gòu)。細(xì)胞自噬行使其生物學(xué)功能的前提是自噬流的話化。大量證據(jù)表明自噬流受損與多種慢性炎性疾病，特別是、神經(jīng)退行性疾病及組織纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，目前對于自噬液的檢別是自噬與其相關(guān)疾病研究領(lǐng)域的熱點。由于自噬流是一個曲多個步驟組成的動態(tài)過程。因此往需要精細(xì)的突驗才能準(zhǔn)確判斷自啦流狀態(tài)。

 細(xì)胞ELISPOT檢測    

     1．培養(yǎng)板的預(yù)處理：在24孔培養(yǎng)板內(nèi)加0.5ml 0.2%戊er醛，37℃，4h，棄掉板中的處理液，用PBS洗滌3次，每次3min；

     2．抗原包被：將適量抗原溶于包被緩沖液中，每孔加入0.5ml，4℃過夜，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     3．制備細(xì)胞懸液：將待測已致敏小鼠處死，取出pi臟，置于加有Hanks液的平皿內(nèi)，用鈍頭直角9號zhu射器針頭破少許脾被膜后，趕出細(xì)胞，用毛細(xì)吸管輕輕吹散細(xì)胞團(tuán)后，將懸液通過250目尼龍網(wǎng)，取濾液，1000r/min離心5min，Hanks液洗滌3次，計數(shù)細(xì)胞后，用1640液重新懸浮細(xì)胞，配成所需濃度；其檢測原理為huo細(xì)胞內(nèi)線粒體中的琥珀酸脫氫酶能催化外源性無色的MTT形成藍(lán)色的結(jié)晶Formazan，并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。

     4．往各孔中加入0.5ml含不同濃度（104-106/ml）的細(xì)胞懸液，置37℃，5％CO2條件下孵育2-4h，棄掉培養(yǎng)液，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃過夜，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     6．加入辣根過氧化物酶結(jié)合的親合素（Avi-HRP）（2μg/ml），37℃孵育30min，棄掉液體，PBS-T洗滌3次，每次3min；

     7．配制明膠-底物液：在37℃水浴中，將2.5mlTMB溶液（4mg/ml  jia醇溶液）滴加入7.5ml10%明膠溶液（用pH5.0磷酸鈉-檸檬酸緩沖液配制）邊加邊攪，溶液呈白色，加入14μl 3% H202；

     8．顯色與計數(shù)：將培養(yǎng)板底冰浴，每孔加入0.6ml明膠-底物液，約3min，混合液凝固，將培養(yǎng)板取出，置室溫5min，將板倒置，用肉眼和低倍放大鏡計數(shù)所顯示出的顏色的斑點。

小鼠成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立

細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用奠定基礎(chǔ).方法利用24 h內(nèi)新生小鼠顱骨和4~8周齡成年小鼠四肢長分別分離、培養(yǎng)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，采用間接接觸的培養(yǎng)模式將接種了骨sui單核細(xì)胞的玻片或骨片置入提前24 h接種了成骨細(xì)胞的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng).共培養(yǎng)-定時間后進(jìn)行破 骨細(xì)胞抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP染色鑒定和骨吸收功能檢測，并進(jìn)一 步采用RT- PCR對破骨細(xì)胞標(biāo)志酶基因基質(zhì)金屬蛋白酶.9(MMP-9)、TRAP 和組織蛋白酶K (Cathepsin K )的表達(dá)進(jìn)行檢測結(jié)果共培養(yǎng)5天后可觀TRAP( )多核細(xì)胞形成13天TRAP( )多核細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰;骨吸收陷窩在共培養(yǎng)7天后開始出現(xiàn),隨著培養(yǎng)時間的延長,陷窩面積呈增加趨勢;破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAP在共培養(yǎng)3天時開始表達(dá)，而MMP-9和Cathepsin K則在共培養(yǎng)5天后表達(dá)結(jié)論共培養(yǎng)體系中成骨細(xì)胞對破骨細(xì)胞調(diào)控作用顯著誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞具有噬骨能力，該共培養(yǎng)模型可用于成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞之間的相互調(diào)控作用研究.