實(shí)時(shí)定量pcr泌尿生殖系統(tǒng)模型「英瀚斯」

單核苷酸多態(tài)性( SNP )實(shí)驗(yàn)

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即單核苷酸多態(tài)性 ,是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計(jì),在人類基因組中,大約每千個(gè)堿基中有一個(gè)SNP ,無(wú)論是比較于度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標(biāo)記(STR) ,都要廣泛得多。大部分線粒體基因由于其母系遺傳特性以及進(jìn)化速率較快等特點(diǎn)，被廣泛地用于種群遺傳學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、譜系地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育學(xué)、疾病診斷等學(xué)科領(lǐng)域。

實(shí)驗(yàn)方法原理:

SNP (Single Nucleotide Polymorphisn即單核苷酸多態(tài)性,是由于單個(gè)核苷酸改變而導(dǎo)致的核酸序列多態(tài)性(Polymorphism)。據(jù)估計(jì),在人類基因組中,大約每千個(gè)堿基中有一個(gè)SNP ,無(wú)論是比較于限制性段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)分析還是微標(biāo)記(STR) ,都要廣泛得多。SNP是我們考察遺傳變異的單位,據(jù)估計(jì),人類的所有群體中大約存在一千萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)。-般認(rèn)為,相鄰的SNPs傾向于一起遺傳給后代。 于是,我們把位于染色體上某一區(qū)域的一組相關(guān)聯(lián)的SNP等位位點(diǎn)稱作單體型( haplotype b大多數(shù)染色體區(qū)域只有少數(shù)幾個(gè)常見(jiàn)的單體型(每個(gè)具有至少5%的頻率),它們代表了一個(gè)群體中人與人之間的大部分多態(tài)性。凝膠阻滯遷移電泳檢測(cè)服務(wù)（EMSA）凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（electrophoreticmobilityshiftassay，EMSA）是一種研究DNA/RNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA/RNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。-個(gè)染色體區(qū)域可以有很多SNP位點(diǎn),但是我們一-旦掌握了這個(gè)區(qū)域的單體型,就可以只使用少數(shù)幾個(gè)標(biāo)簽SNPs(tagSNP)來(lái)進(jìn)行基因分型,獲取大部分的遺傳多態(tài)模式。

miRNA測(cè)序

microRNA(miRNA)是一種大小約21—23個(gè)堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70-90個(gè)堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過(guò)Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（雙鏈）但是和siRNA密切相關(guān)。microRNA通過(guò)和靶基因mRNA堿基配對(duì)引導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解mRNA或抑制mRNA的翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控蛋白表達(dá)（新發(fā)現(xiàn)miRNA也能在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因表達(dá)）。miRNA在物種進(jìn)化中相當(dāng)保守，在動(dòng)物、植物和真菌等中發(fā)現(xiàn)的miRNA表達(dá)均有嚴(yán)格的組織特異性和時(shí)序性。腺病毒是一種無(wú)包膜的球型結(jié)構(gòu)的病毒，遺傳物質(zhì)為線型雙股DNA形式。miRNA在細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中起多種作用，包括調(diào)控發(fā)育、分化、凋亡和增殖等。

目前研究miRNA的方法主要是realtime-PCR、生物芯片技術(shù)以及第二代測(cè)序技術(shù)。基于第二代測(cè)序技術(shù)的miRNA測(cè)序，可以一次獲得數(shù)百萬(wàn)條miRNA序列，能夠快速鑒定出不同組織、不同發(fā)育階段、不同疾病狀態(tài)下已知和未知的miRNA及其表達(dá)差異，為研究miRNA對(duì)細(xì)胞進(jìn)程的作用及其生物學(xué)影響提供了有力工具。lncRNA-Seq可一次性獲得樣本中全部的lncRNAs信息，對(duì)lncRNAs的類別、功能進(jìn)行的深入分析，從而快速準(zhǔn)確地獲得與特定生物學(xué)過(guò)程（例如發(fā)育、疾病等）相關(guān)lncRNA信息。

基因組甲l基化水平(Methyl ati on Content)的分析:

1.高l效液相色譜(Hi gh-performanceLi qui dChromatography, HPLC)HPLC是- -種比較傳統(tǒng)的方法,是根據(jù)DNA或蛋白分子量和構(gòu)象的不同而使其加以分離。由于在動(dòng)態(tài)相和靜態(tài)相下分子的光吸收度并不相同而加以定量。隨著系統(tǒng)的壓強(qiáng)的增加，其分辨率增l高。故而能夠定量測(cè)定基因組整體水平DNA甲l基化水平。該方法由Ruo等1980年首l次報(bào)道。過(guò)程是將DNA樣品先經(jīng)鹽酸或氫l氟酸水解成堿基，水解產(chǎn)物通過(guò)色譜柱，結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)品比較，用紫外光測(cè)定吸收峰值及其量，計(jì)算5 mC/(5mC 5C)的積分面積就得到基因組整體的甲l基化水平。分子組技術(shù)人員畢業(yè)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院、浙江理工大學(xué)等高校生物醫(yī)學(xué)相關(guān)專業(yè)，全部具有碩士研究生以上學(xué)歷，熟練掌握分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)，可開(kāi)展多種分子生物學(xué)檢測(cè)服務(wù)。這是一種檢測(cè)DNA甲l基化水平的標(biāo)準(zhǔn)方法。

2.高l效毛細(xì)管電泳法(Hi gh-per formance Capillary Electrophoresis, HPCE)這是一-種利用窄孔熔融石英毛細(xì)管來(lái)從復(fù)合物中分離不同化學(xué)組分的技術(shù)。其基礎(chǔ)是在強(qiáng)電場(chǎng)下不同分子的由于其所帶電荷，大小，結(jié)構(gòu)以及疏水性等不同而相互分開(kāi)。用HIPCE方法處理DNA水解產(chǎn)物來(lái)確定5mC水平，簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)且敏感性高。,溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活,因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫(5度以下)操作。

凝膠阻滯遷移電泳檢測(cè)服務(wù)（EMSA）

凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）是一種研究DNA/RNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA/RNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。依據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，設(shè)計(jì)標(biāo)記探針、非標(biāo)記探針、蛋白特異性抗ti等參照物，基于DNA-蛋白質(zhì)或RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體在聚bing烯酰胺凝膠電泳（PAGE）中有不同遷移率的原理，當(dāng)轉(zhuǎn)錄因子與特異的DNA或RNA結(jié)合后，其在PAGE中的遷移率將小于未結(jié)合核蛋白轉(zhuǎn)錄因子的DNA，從而檢測(cè)到活化的與DNA或RNA結(jié)合的蛋白轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)因子。標(biāo)準(zhǔn)的生物信息學(xué)分析能夠得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究?jī)?nèi)容，靶向調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、ceRNA網(wǎng)絡(luò)、共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析可以將這幾種RNA聯(lián)合起來(lái)分析，從而發(fā)現(xiàn)新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模型。